原子力显微镜利用针尖与样品表面原子间的范德华力作为反馈信号,维持针尖样品间作用力恒定,同时针尖在样品表面扫描,从而得知样品表面的高低起伏。afm原子力显微镜的基本结构与STM相似,原子间作用力的检测主要由光杠杆技术来实现。如果探针和样品之间有力的作用,悬臂将会弯曲。为检测悬臂的微小弯曲量,采用激光照射悬臂的尖部,探测器就可检测出悬臂的偏转。在扫描的同时,通过记录反馈信号即可获得样品表面的形貌。由于原子力显微镜可以在蛋白质母液中进行扫描,因此是研究蛋白质晶体形核、生长、及晶体缺陷的有力手段。、
晶体质量越高,通过X射线衍射解析获得的结构信息也越详尽、丰富,意义和价值越大。而高质量的晶体就意味着更少的内部缺陷,所以对缺陷进行研究,并减少各种缺陷尤为重要。afm原子力显微镜对生物大分子晶体的研究发现了大多类似无机物的缺陷,包括零维缺陷,如空位缺陷和替代缺陷;一维缺陷,如位错;二维缺陷如堆垛层错和孪晶;三维缺陷,常见的包括微粒的包埋、沉淀和组合。生物大分子晶体对杂质很宽容,允许其结合。生物大分子晶体缺陷的数量和密度较大,数量级约为小分子晶体的2～4倍,这可能导致晶体的破裂和多晶的形成,进而降低晶体质量及衍射数据的可靠性,甚至阻止晶体生长。生长液的纯度是影响蛋白质晶体生长重要因素之一。母液中可能有百分之几的杂质,这些杂质显著影响晶体的溶解性、生长速度和形态,甚至直接导致晶体的破裂。杂质的结合有助于异质形核。在生长过程的早期,蛋白质溶液的过饱和度和生长速度都很大,如果杂质此阶段结合,很可能不脱离晶体表面。而随着晶体的生长,生长速度降低,杂质的结合也降低。
应用原子力显微镜研究杂质结合和晶体质量之间的关系,均得出杂质可降低晶体质量的结论。Yoshizaki等发现当加入5%的杂质,溶菌酶晶体面变得粗糙,B因子显著降低;当加入10%的杂质,生长台阶消失。对比商业用和再提纯后的溶菌酶晶体的面,发现前者出现了大量由共价溶菌酶二聚物才能形成的小颗粒,后者表面平滑,从而得到商业用晶体质量低于再提纯晶体的结论。Plomp等把杂质密度较高的母液换为净化后的母液,发现生长台阶很粗糙的刀豆球蛋白晶体的表面杂质密度降低,而且螺旋位错附近的螺旋生长台阶变成带直边的多边形,X衍射分辨率从大于2.8ÜA提高到2.0Ü杂质阻止台阶生长,进而导致晶体生长的停止。对一些大分子和病毒晶体的afm原子力显微镜研究表明,此机制导致了大分子晶体不可挽回的生长停止。若停止生长的小晶体接种到“新鲜”的过饱和溶液,通常不会长大;然而,如果在接种之前把晶体切片,新鲜表面就会继续生长。原子力显微镜观察结果表明杂质结合的出现是籽晶播种到“新鲜”溶液时常失败的主要原因。这种机制如何使大分子晶体生长停止呢?当一开始,在溶液中形成形核,过饱和度很大,不稳定的生长速度很高。只要杂质结合时间比生长层暴露时间长,少数结合的杂质就会埋入到生长层中。长大的晶体逐渐消耗大分子浓度,溶液的过饱和度降低,生长层的暴露时间增加,那么,杂质的覆盖面积也就会增加。
随着低温afm原子力显微镜,高速原子力显微镜,碳纳米管探针等技术的发展,afm原子力显微镜的分辨率和动力学性能将进一步提高,未来的研究可能集中在以下几个方面:
①继续晶体生长机制研究,包括分子间相互作用机制研究,如蛋白质和DNA、蛋白质之间、蛋白质和固体衬底间的相互作用,以及在各种衬底上生物大分子纳米结构的吸附,而这正是生物材料、生物加工、生物薄膜研究的基础;
②缺陷的深入研究及相关理论的发展,为提高晶体质量提供理论指导;
③对X射线衍射解析晶体结构的辅助作用,例如可以观察到单个分子,其精细结构有助于结构模型的构建,而单层生长台阶的高度,则提供给我们分子尺寸的精确信息。