扫描探针显微镜基本的工作原理为：它是利用探针和样品表面原子与分子之间的相互作用，也就是当探针和样品表面在接近纳米距离的时候，能够产生各种相互作用的物理场，然后在通过检测其相应的物理量，*终获得样品表面的形貌。扫描探针显微镜是由探头，扫描仪，位移传感器，控制器，检测系统以及图像系统组成的。
控制器通过扫描器沿着垂直的方向上移动样品，使得探头和样品之间的距离（或者说是物理量的相互作用）一直稳定在一个固定值上；同时，控制器在水平方向上移动样品，使探头能够按照扫描的路径去扫描样品的表面。扫描探针显微镜在稳定探针和样品之间的距离的条件下，检测探针与样品间的相互作用的有关的物理信号，在稳定的相互作用物理量的情况下，通过位移传感器在垂直方向上检测探针与样品之间的距离。图像系统能够根据其检测到的信号信息（或者是探头和样品之间的距离）对样品的表面进行成像。
根据探针和样品相互作用的不同的物理场，把扫描探针显微镜分成了不同系列的显微镜。扫描隧道显微镜（STM）和原子力显微镜（AFM）就是其中两种不同的扫描探针显微镜。扫描隧道显微镜是通过测量探针与样品之间的隧道电流来检测出样品的表面结构。原子力显微镜是通过光电位移传感器来检测探针与样品之间的作用力（吸引力或者是排斥力）引起的微悬臂梁变形。
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