英国谢菲尔德大学的S. J. Foster和J. K. Hobbs教授团队使用活细胞和纯化的肽聚糖，应用原子力显微镜对形态不同的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌进行了检测。活细胞的成熟表面以大（直径高达60nm）、深（高达23nm）的孔隙构成无序的肽聚糖凝胶为特征。内肽聚糖表面由更多新生物质组成，密度更大，聚糖链间距通常小于7nm。内表面结构取决于位置。枯草杆菌的柱体具有密集的周向取向，而在金黄色葡萄球菌和两个物种的分裂间隔中，肽聚糖密集但随机取向。
将指数生长的金黄色葡萄球菌细胞固定在硅衬底上的微加工孔中，并使用小悬臂、小振幅AFM原子力显微镜实时成像。大型扫描重现了金黄色葡萄球菌的已知网状结构（成熟）和环状结构（新显示的分割平面）。高分辨率原子力显微镜显示，网格是随机定向的，宽度不同，孔隙深度高达23 nm。由于壁厚约为20 nm，一些孔隙要跨越大部分壁。壁磷壁酸或脂磷壁酸，缺乏主要的壁相关聚合物并没有实质性地改变结构，这与观察到的肽聚糖特征一致。单个股线具有可变宽度（平均6.0±3.8 nm，n=45；），在某些情况下几个单独的股线聚集在一起，因此认为这些纤维通常是多分子的。肽聚糖在外壁的分布密度低得惊人。通常在11±3.4 nm（n=5）的深度处仅填充50%。因此成熟壁外部区域是多孔凝胶，即液体介质中的三维固体网格。
表面环结构（归因于新生的间隔材料）*初是分子密集的，由径向波纹群组成，这些波纹群由周向排列的单链组成，在*密集的区域间隔2.7±0.5 nm（n=16）。新生环材料中长聚糖链的观察支持肽聚糖水解酶在细胞生长相关壁成熟中的作用。无序网格和有序环之间的界面是尖锐的。细胞分裂发生在连续的正交平面上。由于看不到与上一代细胞环正交的环结构，在这些生长条件下细胞环在单个分裂周期内转变为网状结构。
活细胞成像**于外表面，不能区分成分。研究表明在空气中对提取、纯化的细胞壁肽聚糖进行成像可以通过细胞周期对细胞壁结构提供有用的见解。在这里，小囊在液体中成像，敲击固定后球囊碎片展示了活细胞环和网状结构。重要的是在单个球囊内使用AFM原子力显微镜观察内表面和外表面。获得的每个内表面图像（n=80）显示出一个紧密、无序的网格，可能由单链（宽度2.8±0.8 nm，n=45）构成，孔隙直径小于6.4 nm（n=158）占总孔隙面积的一半，大大小于活体外表面上的孔隙（39 nm, n=310）。不完全隔面对细胞质的表面上不存在环，而是有一个紧密、无序的网状结构，类似于内表面的其余部分（n=25）。环形建筑**于上一代的后分区分隔外表面。从环到网格的成熟可能通过表面环的丢失和重组而发生，揭示了底层无序网格。细胞壁的*终结构取决于细胞壁合成酶和水解酶之间的相互作用。去除其中一种肽聚糖合成酶PBP4会导致更密集的环状结构，偶尔会持续到**代表面之外。从环到多孔网状结构的转变主要是由于肽聚糖水解酶的作用。
为了探索观察到的普遍性对杆状枯草杆菌进行了研究。将指数生长的活细胞固定在细胞涂层云母上并成像。细胞柱呈现出无序的网状结构，具有可变厚度（4.5±1.9 nm，n=111），类似于金黄色葡萄球菌，与之前提出的圆周定向特征相反。对单个细菌的连续纵向成像显示远离两极的结构没有变化。沿细胞柱观察到15 nm深的孔隙。枯草杆菌活细胞极由于其相对于探针尖DUAN的方向难以用原子力显微镜成像。然而，圆柱-磁极界面显示了磁极相关的环形结构。
纯化枯草杆菌球囊的成像显示圆柱体的外表面为随机取向的网状物，杆为环状物和网状物。相比之下，球囊圆筒的内表面显示出的特征将大致围绕体内圆周定向，长度范围从明显的单聚糖到更大的结构，之前在中成像的样本中被解释为“电缆”，并且可能与cryo-EM中描述为“周向特征”的对比度有关。与螺旋组织相比单个股线的内部方向是围绕细胞的圆周方向。去除MreB细胞形状决定蛋白家族产生的具有随机取向链的球形细胞，这意味着这些成分负责这种圆周取向。枯草杆菌不完全隔壁面向细胞质的一侧有一个无序的网状结构，带有随机取向的链。它的表面也有明显的气孔。成熟极的内表面显示出无序、相对致密的结构，这表明不完整间隔中的孔隙很可能是充填的，与前缘间隔合成无关。之前在干燥样品上观察到的更复杂的隔膜结构可能来自脱水过程中“外部”环和“内部”网施加的约束之间的相互作用。
金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的纯化成熟球囊（肽聚糖+WTA）水合时厚度分别为36±5.3nm（n=25）和34±10nm（n=19），干燥时厚度分别为17±2nm（n=25）和9±1nm（n=19）。之前的cryo EM分析显示从活细胞到提取的水合球囊的壁厚增加了约50%。即使在面向细胞质的壁表面上肽聚糖也有一个相对多孔的结构，不像传统的致密壁。这就提出了一个问题，即它如何发挥抑制细菌膨胀压力的作用。为了使膨胀导致溶解，膜要通过壁向外膨胀，克服膜的弯曲模量。弹性变形能的计算表明，直径为8 nm的孔可以支持约20 bar的内部膨胀压力，也就是说观察到的孔足够小，足以支持细胞膜上的预期内部压力。
本文提供的数据和解释来自活细胞和在液体中成像的球囊，与之前研究中在空气中采集的干燥球囊数据存在显著差异。活细胞图像显示，成熟细胞壁是多孔的网状水凝胶。液体中球囊的图像显示出与活细胞数据类似的特征，并且与干燥球囊相比，由于水化膨胀，厚度大幅增加。作者认为目前的研究和以前的研究之间的显著差异反映了干燥球囊的塌陷性质，与含水的革兰氏阳性细胞壁固有的3D性质相比。这种对细胞壁结构的新理解为细胞肽聚糖动力学所需的成分设置了限制。对两种形态多样的细菌的分析揭示了之前未观察到的共性水平。
总之，作者使用活细胞和纯化的肽聚糖，应用AFM原子力显微镜对形态不同的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌进行了检测。活细胞的成熟表面以大、深的孔隙构成无序的肽聚糖凝胶为特征。内表面结构取决于位置。枯草杆菌的柱体具有密集的周向取向，而在金黄色葡萄球菌和两个物种的分裂间隔中，肽聚糖密集但随机取向。揭示细胞外膜的分子结构有助于理解其力学性质和作为环境界面的作用，为传统的结构生物学方法提供补充信息。
参考文献：
J. K. Hobbs et al. The architecture of the Gram-positive bacterial cell wall. Nature, 582, 294-297, 2020.
DOI: 10.1038/s41586-020-2236-6.
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2236-6